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环形细胞侵袭实验--使细胞侵袭的过程可视化
发布时间:2016-06-03   点击次数:495次

肿瘤细胞的侵袭能力是肿瘤转移的一个重要特征。为了研究肿瘤细胞侵袭过程的机制,一系列体外细胞实验建立起来,用于研究细胞侵袭基底膜和基质的过程。体外侵袭实验首先是采用人工重构基底膜材料Matrigel,可以在37℃逐渐凝固成胶,结构与天然基质膜结构极为相似。通常的实验是在孔径8μm的滤膜上铺上一层Matrigel,细胞不能自由穿过,必须分泌水解酶,并通过变形运动才能穿过。实验之后通过对穿过“基质膜”的细胞进行计数,来确定细胞的侵袭能力。这一方法非常仿真的模拟了细胞在生物状态下的侵袭过程,但是其也有一定的局限性。由于滤膜的不透光性,使得直接观察细胞伪足和骨架变化变得非常困难。

 

英国的科研人员改进了肿瘤侵袭实验,设计了一种环形细胞侵袭实验,使得操作进一步简化,并且也能模拟3D侵袭。重要的是,能够使侵袭过程中的活细胞或者是固定的细胞可视化。借用这个实验方法,研究人员发现侵袭过程中主要有蛋白酶参与其中。研究发现,在3D侵袭的细胞中蛋白酶会聚集在伪足和细胞的粘附点上。

 

Cells Assemble Invadopodia-Like Structures and Invade into Matrigel in a Matrix Metalloprotease Dependent Manner in the Circular Invasion Assay

X. Yu and L. M. Machesky

PLoS ONE, 2012, 10.1371/journal.pone.0030605

 

 

(一)实验材料

  • 细胞:   MDA-MB-231
  • 实验耗材:  伤口愈合插件         (ibidi,80209)

               玻璃底培养皿      (ibidi,81158) 

  • 试剂:    Matrigel           (BD)

             4%多聚甲醛溶液

             0.1%Triton X-100

 

(二)实验步骤

  • 将ibidi伤口愈合插件放入ibidi玻璃底培养皿中间
  • 在插件外部铺 6 × 105 MDA-MB-231细胞,等待细胞贴壁
  • 细胞贴壁后移除伤口愈合插件,在细胞形成一个0.8cm2的空白区域
  • 加入250μl50% BD Matrigel (4.5mg/ml),将培养皿内层刚好铺满,能形成一个0.8mm厚度的“基质膜”
  • 孵育2小时,使Matrigel固化,加入培养基
  • 在37C培养箱中孵育24小时。
  • 4%多聚甲醛溶液固定30分钟,并以 0.1%Triton X-100通透30分钟后可以加入DAPI或者抗体染色

 

 

  • 实验结果

 

 

1、使用环形细胞侵袭实验能够观测到细胞侵袭中的活动(图一)

 

 

 

图一:MDA-MB-231细胞在环形细胞侵袭过程中形成了侵袭链:A)MDA-MB-231细胞在matrigel中形成了一个长的侵袭链 B)勤洗脸的免疫荧光图,红色为Actin,蓝色为细胞核

 

 

2. 使用环形侵袭实验能够记录对比侵袭速率和侵袭面积(图二)

 

 

 

图二:MDA-MB-231细胞侵袭过程受MMP调控。加入25μM的GM6001能显著的减缓侵袭速率和侵袭面积。

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